T.U.F.F. Puppy er en animeret tegneserie om den energiske hundehvalp Duddly, der ved en fejltagelse ender i rollen som hemmelige agent i organisation T.U.F.F. Her kæmper han for at forsvare byen Petropolis mod den frygtelige dyreorganisation D.O.O.M. sammen med Kitty Kaswell, en feministisk kat, der er ekspert i kung-fu og våben. D.O.O.M. giver ikke op før hele Petropolis er væltet med hele verden som deres slaver og Dudley a.k.a. T.U.F.F. Puppy er ude af spillet - eller i det mindste er blevet kastreret. Hverken Kitty eller Dudley har dog tænkt sig at give op uden en kamp!